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ELISA操作常见问题和解决方法
更新时间：2015-09-23
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ELISA操作常见问题和解决方法
ELISA即酶联免疫吸附实验，是目前广泛应用于各种抗原抗体检测的方法，主要有灵敏度高和特异性强的特点。ELISA操作步骤看似简单，整个测定过程中却有诸多影响因素，导致检测结果可能与实际结果偏差较大。为帮助大家分析实验中常见问题，我们将常见问题的可能原因和解决方法归纳总结于下表：
问题一：高背景或阴性对照值偏高
可能原因 | 建议 |
阴性对照孔被阳性对照或样品污染 | 洗涤时，勿将洗液溢出孔外。 |
洗涤不充分 | 确保在洗涤时每个孔都充满了液体，确保将残余液体从孔中移除。 |
酶结合物过浓 | 请检查酶结合物是否按说明书规定稀释 |
孵育温度过高 | 检查孵育箱的温度是否正确、稳定 |
底物在使用前曝光 | 应保存在暗处，避光。 |
读板前停留时间过长 | 加终止液后3分钟内读数 |
问题二：阳性对照值偏低或低吸光度
可能原因 | 建议 |
蒸发 | 各步之间，须使用封版胶密封反应板。 |
温度不均匀 | 校准孵育箱，勿叠放反应板。 |
问题三：边缘效应
可能原因 | 建议 |
蒸发 | 各步之间，须使用封版胶密封反应板 |
温度不均匀 | 校准孵育箱，勿叠放反应板 |
问题四：标准曲线不佳
可能原因 | 建议 |
倍比稀释标准品时未混匀 | 稀释标准品的每一步均需混匀 |
过早稀释 | 标准品在快要使用时稀释 |
加入的体积不正确 | 使用校准过的移液器，快速、等量的将标准品分配到各个微孔中 |
问题五：标准曲标准曲线良好，但样本无检测信号
可能原因 | 建议 |
样本中无检测物或检测物含量极低 | 设置内参，重新实验 |
样本中其他物质影响/掩盖检测 | 作适当稀释，降低其他物质的干扰，或作系列稀释，检测回收率。 |
样本中检测物浓度过高，Hook效应导致假低值 | 适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内。 |
问题六：重复性较差
可能原因 | 建议 |
微孔中有气泡 | 用针尖挑破气泡 |
试剂未混匀 | 确保充分混匀试剂 |
样本中有杂质或沉淀物 | 使用前离心 |
微孔包被面被吸头划破 | 加液时小心操作 |
使用用过的封板胶纸 | 每次须使用新的封板胶封住反应孔 |
