可溶性凋亡基因sCD95（APO1/Fas） ELISA 试剂盒

更新时间：2013-06-19

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sCD95（APO1/Fas） ELISA 试剂盒

用途：

人sCD95 ELISA 试剂盒用于体外定量检测人血清、血浆、缓冲液或细胞培养液中的可溶性

CD95（APO-1, Fas）。本实验可以检测天然的和重组的sCD95。本试剂盒于研究，而非

用于诊断。

试验原理：

sCD95 试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）?？箂CD95 特异单克隆抗体包被

微孔板，已知sCD95 浓度的标准样本、对照样本和未知样本加入微孔进行检测。

先将sCD95 抗原和生物素标记的抗sCD95 特异单克隆抗体同时孵育。洗涤后，加入亲和

素过氧化物酶。再经过孵育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入酶复合物的作用底物，产生

颜色反应。颜色的深浅和样本中sCD95 的浓度呈比例关系。

提供的试剂和配制方法：

试剂（2~8℃保存）	数量	色标	配制
96 微孔板	1		即用型
塑料盖板	2
标准品：3000pg/ml	2 支冻干粉	黄色	按标签要求以标准稀释液稀释
对照	2 支	银色	按标签要求以标准稀释液稀释
标准稀释缓冲液	1 支（25ml）	黑色	10X, 用蒸馏水稀释
生物素标记抗sCD95	1 支（0.4ml）	红色	用生物素标记抗体稀释液稀释
生物素标记抗体稀释液	1 支（13ml）	红色	即用型
亲和素HRP	2 支（5ul）		0.5mlHRP 稀释液预稀释
HRP 稀释液	1 支（23ml）	红色	即用型
洗涤液	1 支（10ml）	白色	200X, 用蒸馏水稀释
TMB	1 支（24ml）		即用型
硫酸终止液	1 支（11ml）	黑色	即用型

试验需要但未提供的用品：

?? 蒸馏水

?? 微量加样器：10ul,50ul,100ul,200ul,1000ul

?? 旋涡振荡器和磁力搅拌器

安全性：

?? 仅用于科研

?? 本试验所用的人血成分均经检测，不含有HbsAg 和抗HIV 阳性物质。尽管如此，无法

确保没有传播肝炎或艾滋病等的可能。因此处理这些血清、血浆样本时，应该遵守

有关的安全操作规程，例如CDC/NIH 健康手册：“微生物学和生物医学试验中的安全”

/1984。

→ 避免硫酸和TMB 与皮肤接触。如有接触，可用水*冲洗。

→ 不可在使用试剂盒的地方吃饭、饮水、吸烟或化妆。

→ 不可用口吸取样本。

操作要点/试验室质量控制：

1、使用前应根据标签上指示冷藏。使用时所有试剂应平衡至室温。冻干标准品使用后

应丢弃。

2、取出所需的孔条后，立即密封包装，以防变质。

3、不用时所有试剂要加盖封好。

4、不同批号的试剂不可混用。

5、过期的试剂不可再用。

6、使用干净的吸头来吸取各种试剂、标准品、对照或样本，以防交叉污染。吸取硫酸

或底物溶液时，避免使用带金属部分的加样器。

7、用干净的塑料容器配备洗涤液。

8、使用前用振荡器*混匀各种试剂。

9、微孔内残留液须充分吸干或在吸水纸上拍干，吸水纸不可插入孔内吸水。

10、 TMB溶液是光敏的，避免长时光照。避免与金属接触产生颜色反应。

警告：TMB 有毒，避免手直接接触，并妥当处理。

11、如配制后几分钟产生深兰色，表明TMB 溶液被污染，必须弃去。在检测完成

后一小时内必须读结果。

12、吸取样本时，按顺序逐孔加样，以确保孵育时间相同。

13、孵育时间见操作规程。

14、在洗涤微孔板之后15 分钟内加入TMB 溶液。

样品收集，处理和保存

1、细胞培养上清液——1000xg 离心10 分钟去除颗粒和聚合物。

2、血清——操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液

后，1000xg 离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

3、血浆——EDTA，柠檬酸盐和肝素血浆可用于检测。1000Xg 离心30 分钟去除颗粒。

4、保存——如果样品不直接使用，将其分为小部分（250-500ul）-70℃下保存，避免

反复冷冻。如果可能，不要使用溶血和高脂血。如果血清中有大量的颗粒，检测前

先离心或过滤。

注意：不要在37℃或56℃加热解冻。在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

试剂准备：

1、标准稀释缓冲液

蒸馏水10 倍稀释。

2、标准品

按标签要求以标准稀释液配制，其浓度为3000pg/ml sCD95，可储存。稀释前轻轻

振荡此标准品5 分钟。每次实验前将此标准品进行系列稀释，不能保存。

3、对照

按标签要求以标准稀释液配制。加样前轻轻振荡对照5 分钟。稀释后不能储存。

4、生物素标记抗sCD95 的稀释

生物素标记抗sCD95 用生物素标记抗体稀释液根据使用微孔数在干净玻璃管中

稀释。试验时准备。参见下表：

使用微孔数	生物素标记的抗体（ul）	生物素标记抗体稀释液（ul）
16	40	1060
24	60	1590
32	80	2120
48	120	3180
96	240	6360

5、亲和素HRP 的稀释

在含5ul 亲和素HRP 的瓶内加入0.5ml HRP 稀释液。本液为一次性使用。

根据使用微孔数在干净玻璃管中进一步稀释。参见下表：

使用微孔数	亲和素HRP（ul）	HRP 稀释液（ml）
16	30	2
24	45	3
32	60	4
48	75	5
96	150	10

6、洗涤缓冲液的稀释

蒸馏水200 倍稀释。

检测方法：

1、试剂用前充分混匀，避免产生泡沫。

2、确定需要的微孔数，所有样本、标准品、空白和对照样本均要做双份。

3、加100ul 配好的标准稀释液至标准孔B1,B2,C1,C2,D1,D2,E1,E2,F1,F2。（配制见前

述）吸取200ul 标准品加入A1,A2。（见下表）从A1,A2 中吸取100ul 至B1,B2 孔内；

反复吸排，使之混合。重复此步骤，从B1,B2 至C1,C2，然后从C1,C2 至D1,D2 等等。

sCD95 标准稀释液浓度由3000 至93.75pg/ml。从zui后的F1,F2 孔内吸取100ul 弃掉。

4、加100ul 配好的标准稀释液至空白孔G1,G2。

5、加100ul 样本至样本孔和100ul 对照品至对照孔H1,H2。

6、配制生物素标记的抗sCD95。（配制见前述）

7、加50ul 生物素标记的抗sCD95 稀释液于所有孔内。

8、盖上微孔板，室温下（18 至25℃）孵育1 小时。

9、洗涤微孔板：① 吸去孔内液

② 加0.3ml 洗涤液于各孔

③ 再吸去各孔内液

④ 重复②和③二次

10、仅在用前配制HRP 液。（配制见前述）

11、加100ulHRP 液于各孔，含空白孔。加盖。

12、室温下孵育0.5 小时。

13、洗涤微孔板。（见步骤9）

14、加100ulTMB 底物液至各孔。室温下避光孵育20 至30 分钟。

15、通常根据ELISA 阅读器确定孵育时间：许多ELISA 阅读器仅读数至2.0 O.D 值。

监察O.D 值，应在阳性结果衰褪前终止反应。（不超过20 分钟）

16、酶底物反应用100ul 硫酸加入各孔内终止。终止反应后1 小时内（这段时间在2

至8℃避光保存）或加入硫酸后立即读取结果。

17、用分光光度仪读数，450nm 作为初始波长，620nm（可以用610 至650nm）作为

参考波长。

建议微孔板编码：

	标准浓度（pg/ml）		样本孔
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	3000	3000
B	1500	1500
C	750	750
D	375	375
E	187.5	187.5
F	93.75	93.75
G	空白	空白
H	对照	对照

结果分析：

制作一条标准曲线，平均光吸收值作Y 轴，对应的sCD95 浓度作X 轴。各样本中的sCD95

含量可根据样本O.D 值通过标准曲线来确定。

本试验的局限性：

超过标准曲线范围（3000pg/ml）时，不可推测结果；样本必须稀释后再检测。

本试验的检测特性：

1、敏感性：zui小检测浓度低于47pg/ml。

2、准确性：

批内					批间
样本	N	均值（pg/ml）	SD	CV%	样本	N	均值（pg/ml）	SD	CV %
A	14	1719	106	6.1	A	8	1752	145	8.2
B	16	703	39	5.5	B	8	856	68	7.9

检测程序小结：总时间 = 1 小时45 分钟

加100ul 样本或配好的标准品或对照

加50ul 配好的生物素标记的抗体于各孔内

室温孵育1 小时

洗3 次

加100ul 亲和素-HRP 标记物

室温孵育0.5 小时

洗3 次

加100ul TMB，避光，显色20 至30 分钟

加100ul 硫酸，终止反应

在450nm 处读取吸光度

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